抗体代替中分子 Ankyron™
Biospecimen1975次世代試薬で、標的への結合と検出を行う際の研究用抗体の課題を克服できます
Ankyron™とは？
Ankyron™は、アンキリンリピートのスキャフォールドに基づく小型(~15 kDa)の単一ドメインで構成されるバインダーです。ProImmune社では、高スループットのin vitroスクリーニングプロセスを用いてAnkyron™クローンを作成し、約1兆個の変異から高親和性のバインダーを選択しています。これらのバインダーは組み換えタンパク質であり、研究ニーズに合った一貫性と柔軟な試薬を提供します。
試薬不足により現在妨げられている研究分野へのアクセス
急速に拡大するAnkyron™のカタログ製品は、現在3,500以上の標的をカバーし、150種以上にわたり19,500以上の組換えクローンを含んでいます。ご希望の標的に対するAnkyron™がまだカタログ化されていない場合は、追加料金なしでAnkyron™クローンのカタログへの追加をご要望頂けます。ターゲットタンパク質(またはその特定のドメイン)はこのプロセスの一環としてProImmune社内で合成されており、効率的かつコスト効率の高いクローン生成が可能にしています。新たなターゲットに対するAnkyron™のリクエストはお問い合わせください。
Ankyron™は抗体と同じ研究用途で使用できます
免疫蛍光染色 – 低分子量かつ近接したラベリングによる高解像度イメージング
免疫組織化学 – Ankyron™を新鮮組織またはFFPE組織中の定常的および実験的な標的に対して使用
フローサイトメトリー – 高特異性かつ低バックグラウンドの細胞内および細胞外染色
ウェスタンブロッティング – 組換えまたは細胞溶解液中の特定のタンパク質を検出します
ELISA – タンパク質標的や抗体アイソタイプの検出のための多様なELISAフォーマットの標的検出
免疫沈殿、細胞培養、Ankyron™技術によって可能となった標的へのデリバリーシステムを含む
Ankyron™の特徴
- 高い親和性
- 抗体と併用可能
- 近接ラベリング
- コスト効率が高く高スループット
- 明確かつ単一のアミノ酸配列
- アニマルフリー
- ターゲットタンパク質の作成を含むカスタムプロジェクトが可能
柔軟なラベル付けとフォーマット
ProImmune社のカタログ単一ドメインAnkyron™には、デフォルトで6HisタグとV5エピトープタグが搭載されており、これらは抗V5二次抗体でラベル付け可能です。V5タグは、用途や研究目的に応じて、直接蛍光タグやビオチンなど様々な代替ラベルに切り替えることができます。
Ankyron™の応用
免疫蛍光染色
Ankyron™は免疫蛍光のための優れた品質の染色を提供します。その小さなサイズにより蛍光色素は結合部位の近くに位置し、高解像度のイメージングが可能です。さらに、小型であるためより穏やかな細胞透過条件を採用可能であり、染色や洗浄の工程も短くなります。抗体を用いた免疫蛍光染色プロトコルと比べて、標準的なAnkyronプロトコルは実験時間を大幅に短縮し、1時間以上節約できます。Ankyron™を使用した実験プロトコルはこちらからご覧いただけます。
免疫蛍光において細胞外、細胞内、核内の標的に到達します
ICAM2
クラトリン
ヒストン
図:左 白血球接着タンパク質LFA-1のリガンドである細胞表面分子ICAM2に対するAnkyron™クローンで染色されたHuvec細胞。真ん中 Clathrinの重鎖1に特異的なクローンで染色されたHCT116細胞。Clathrinは細胞内輸送および有糸分裂細胞の紡錘体組み立てに関与するClathrinタンパク質複合体の重要な構成要素です。右 ヌクレオソームマーカーであるヒストンH3.1に特異的なクローンAE40370によって染色されたHeLa細胞
Ankyronsで染めることによってブロッキング作業を減らし、抗体による染色と比較して時間を節約できます
論文ピックアップ
Mosquito NFKB経路
図:クローンBT40163は、Ae. aegyptiのNF-κB経路のコンポーネントであり、抗ウイルス応答の重要な一部である蚊のREL1Aに特異的なAnkyron™です。データはPirbright研究所のDr. Kevin Maringerのご厚意により提供されました。
P. berghei研究のためのAnti-Gabarap 1 Ankyron
図:Gabarap特異的Ankyron™(クローンAH50324)を用いた免疫蛍光分析。Plasmodium bergheiをHeLa細胞に感染させた後、宿主細胞内で寄生虫が存在する寄生胞性液胞膜(PVM)を構成するタンパク質UIS4を認識する抗体(マゼンタで染色)により検出しました。 1列目は、野生型HeLa細胞をGabarap 1特異的Ankyron™で染色した場合を示しています。2列目も同じ染色ですが、GabarapノックアウトHeLa細胞に対して行っています。 Gabarap 特異的Ankyron™による染色は緑色です。 GabarapはGFP融合Gabarapを用いた過剰発現実験で事前に特定されたPVMに局在しています。
データはスイス Bern大学細胞生物学研究所のDr. Jacqueline Schmuckli およびProf. Volker Heusslerのご厚意によって提供されました。
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーで到達が難しい標的を定量化し評価します。分子量が小さいため、Ankyron™は過酷な細胞膜透過条件を必要とせずに細胞内および核内標的を検出できる効率的な細胞浸透性という利点を持っています。
図 Ki67特異的Ankyron™クローンDS40118に引き続いて抗V5 APC標識二次試薬を用いて染色したHCT116、HeLa、HUVECのフローサイトメトリー解析。HCT116はHeLa細胞よりも増殖が速いのに対し、HUVECは他の細胞株よりも倍増時間が長く、そのためKi67のレベルが低いことがわかります。
図 HeLa細胞核内のKi67をV5タグ付加Ankyron™Ki67特異的クローンDS40112(赤)で、核をDAPI(青)で、phalloidin(緑)でF-アクチンを染色して顕微鏡で検出した結果。
腫瘍学におけるHIF-1αバインダー
図:C57BL/6マウスのNK細胞に対するHIF-1α転写因子特異的Ankyron™(クローンAW40110を用いたフローサイトメトリー染色)。C57BL/6マウスにMC38腫瘍細胞を注射しました。腫瘍および脾臓のNK細胞を単離し、HIF-1αに対する染色を行いました。Ankyron™クローンAW40110による染色では、脾臓内のHIF-1α発現が低いことが明確に示され、腫瘍に由来するNK細胞では上昇しています。データはイギリス・Birmingham大学のDave Withers教授よりご厚意で提供されました
免疫組織化学
Ankyron™を使って新鮮な組織切片やFFPEの組織切片を効果的に浸透させて染色可能です。
FFPE組織切片では、10 μg/mlのV5タグ付きAnkyronおよびHRPラベル抗V5試薬(1/500)を用い、DAB(茶色)で検出し、核をヘマトキシリン(青紫色)で染色します。加熱処理による抗原賦活化(10分)にはLeica BOND RXスライド染色システムとLeica Tris-EDTAバッファー(pH9)を用いた。
IHCのハイライト:ヒト大腸組織におけるAPRIL特異的染色
背景
APRIL(増殖誘導リガンド)は腫瘍壊死因子(TNF)リガンド超ファミリー(TNFSF13、CD256とも呼ばれる)のメンバーであり、受容体であるTACI(TNFRSF13B)およびBCMA(TNFRSF17)と相互作用することでB細胞の成熟、増殖、生存を調節することで体液免疫に重要な役割を果たします。病理学的条件下で、APRILはエリテマトーデスや関節リウマチなどの全身性自己免疫疾患の発症に関与します。多くの他のTNF超ファミリーの配位子とは異なり、APRILはがん細胞の増殖を刺激し、腫瘍形成時に過剰発現することがあります。したがって、自己免疫疾患、免疫グロブリン障害、がんにおいて有用な診断マーカーであり、魅力的な治療標的となっています。
図: パラフィン埋め込みヒト大腸の免疫組織化学的解析を行った。10 μg/mlのV5タグ付加Ankyron® TNF13_HUMAN_ANK03668_3とHRPラベル抗V5試薬(1:500)を用いて、DABで検出(茶色)を用い、核をヘマトキシリン(青紫色)で染色した。加熱処理による抗原賦活化にはLeica クエン酸バッファー(pH6)を用いた。
Ankyron™技術の紹介
機能的効果を持つ高度特異的なCovid Ankyron™
YJ Park, et al., The AAPS Journal (2025), 27:58,“Functional Activity and Binding Specificity of Small Ankyrin Repeat Proteins Called Ankyrons Against SARS-CoV-2 Variants”
図:AnkyronクローンのSARS-Cov-2スパイクタンパク質に対する特異性はバイオレイヤー干渉法を用いて実証されました
Ankyron™のウイルス逃逸変異体発生に対する保護効果は、臨床的に評価されたmAbと同等です。Ankyron™の高スループット選択は、流行やパンデミックを引き起こすウイルスに対する中和剤を急速に開発する大きな可能性を秘めています。
図:各AnkyronのSARS-CoV-2中和滴定は、ACE2/TMPRSS2のHEK293細胞発現上の擬ウイルス中和アッセイを用いて決定しました。この例では、デルタ偽ウイルス(1.0 X 10 6 RLU/mL)を変異特異的アンキロンの3倍希釈でインキュベートしました。
世界初の牛IgG3特異的結合試薬
A Noble, et al., Vet. Immunol. Immunother. (2024), 278, 110852,“Specificity of Ankyron clones against Sars-Cov-2 spike proteins was demonstrated using Biolayer interferometry”
家畜免疫学の調査は、持続可能な農業実践を促進し、人獣共患病の制御を改善し、食品の安全を確保するために重要です。IgG3サブクラスが牛の免疫に果たす役割はこれまで特徴づけられていませんでした。IgG3に対する市販抗体はすべて結合に失敗するか、他のIgGサブタイプとの交差反応を示すことが明らかになりました。私たちのAnkyron™技術により、世界初のIgG3特異的結合試薬の開発が可能となりました。これにより、口蹄疫ウイルスカプシドワクチンを接種した子牛の免疫応答の詳細な特性解析が可能となりました。
図:Ankyron™ AZS40101はELISAアッセイにおいて捕獲試薬または検出試薬として使用可能です。Ankyron™ AZS40101は、組換えウシのIgG1、IgG2、IgG3 mAbを検出するためのELISAキャプチャ(A)または検出(B)試薬として使用されました。2回測定の平均データ±SDが示されています。
Ankyron™技術のその他の応用
誘導選択およびp-MHC特異的バインダー
ProImmune社のガイド選択戦略を用いて、高いホモロジーの標的間の単一アミノ酸差異まで区別できます。私たちの発見処理では、2つのタンパク質標的を並行してスクリーニングし、無関係なタンパク質に結合したクローンを廃棄することで、選択的に反応性のあるAnkyron™バインダーが得られます。この選択戦略が適用された主な例としては、ペプチド-MHC複合体特異的Ankyron™が挙げられます。
多量体化Ankyron™
Ankyron™が定義されたモノクローナル配列を持つ組換えタンパク質であることは、高度にカスタマイズ可能な結合試薬の合成の可能性を拡大します。この方法が応用できる主要な例としては、同じ特異性を持つ複数のコピーを結合したり、異なる特異性を持った多価バインダーを作製するためのリンカーを用いた多量体Ankyron™の開発があります。
Ankyron™と抗体の比較
| Ankyron™ | 抗体 | |
|---|---|---|
| サイズ(MW) | ~15kD シングルドメイン | ~150kD、12ドメイン(IgG) |
| 由来 | Teralibrary™による直接的なin vitro選択 | 動物免疫または抗体ライブラリーからのin vitro選択 |
| 種/アイソタイプ | 特定の動物種に由来しておらず、アイソタイプもありません | 種の起源や種ごとにアイソタイプが異なる |
| 安定性 | 高度に安定した単一ドメイン | 全長抗体は非常に安定 |
| エンジニアリング | 単一の小さなドメインでとても簡単です | 可能性はあるが、より複雑 |
| 遺伝的背景 | モノクローナル、デフォルトで組換え | 状況は様々ですが、ディスカバリーから完全なフォーマットの再構成に至るまでは依然として高額です |
| カスタマイズ | カスタムでコンジュゲーションが可能です。数ヶ月ではなく数日でお届け可能 | カスタムでコンジュゲーションすることは可能ですが、通常はかなりの追加費用がかかります。カスタム試薬は多くの場合、長いリードタイムが必要になります |
| 親和性 | 通常はTeralibraryからの直接選択のみで十分高く、高親和性改変のコストを抑えられます | 大型動物でモノクローナル抗体として生成される場合、または抗体ライブラリからの選択と親和性成熟を経て生成された場合、高くなることがあります |
| 拡散 | 15kDドメインサイズが小さいため高速であり、IF、ICC、IHCでより良い結果が期待できます | 150kDとサイズが大きいことによる制限があります |
| 画像解像度 | 結合部位に非常に近い標識を付けることができ、顕微鏡でより高い解像度を提供する可能性があります | 抗体のサイズに起因して、結合部位に近接した部位へのラベルが困難です |
