T細胞エピトープの発見と検証
Biospecimen1975ペプチドマイクロアレイを用いたHLA結合アッセイを用いてT細胞エピトープを同定します。数千のペプチドをMHCへの提示のためにスクリーニングし、計算予測を実験的に検証し、活性化アッセイで機能的なT細胞応答を確認します。
HLA結合から機能的T細胞応答へ
T細胞免疫は、主要組織適合性複合体(MHC)分子に提示されるペプチドや、それらが引き起こす反応の種類や範囲に依存します。マイクロアレイを用いたヒト白血球抗原(HLA)結合アッセイを大規模に実施することで候補エピトープをスクリーニングし、その下流で実施するアッセイによって、どのペプチドが生物学的に重要な応答を引き起こすかを確認します。
HLA結合エピトープのスクリーニング
特定のHLA対立遺伝子に結合し、T細胞に提示されるペプチドを特定します。
何千ものペプチドを並列にスクリーニングします
ペプチドマイクロアレイベースのアッセイを用いて、組換えHLA分子に対して結合する膨大な数で構成されるペプチドライブラリーを評価します。
HLA制限結合パターンの特定
対立遺伝子特異的な結合モチーフを特定し、結合親和性を比較します。
PBMCサンプルへの依存を低減
細胞検査残余サンプルやドナー由来の細胞を必要とせずに初期スクリーニングを行います。
T細胞エピトープ候補の優先順位付け
多数の配列で構成されるペプチドのセットから、機能的アッセイに入る前にT細胞応答を起こしやすい配列に絞り込みます。
実験的に検証されたバインダーに注目しましょう
in silico予測のみに頼らず、実際にHLAと結合するペプチドを選択することが必要です。
下流のアッセイの複雑さの削減
下流で実施する機能テストを信頼度が高い候補に限定することで、コストや労力を削減できます。
in silico予測の検証
マイクロアレイベースの結合データとin silico予測を比較し、アルゴリズムで見逃されたエピトープを特定したり、予測された配列の結合性を確認したりします。
機能的T細胞応答の検証
候補エピトープが生物学的に関連するT細胞活性を引き起こすかどうかを確認します。
T細胞活性化の測定
ELISpotまたはFluoroSpotアッセイを用いて、ペプチドに反応して引き起こされるサイトカイン分泌を検出します。
T細胞の反応タイプによる特徴付け
フローサイトメトリーを適用して、エフェクター、調節、または記憶T細胞の反応を区別します。
機能的アウトカムの評価
細胞毒性または免疫抑制を評価し、反応が免疫原性か耐容性かを判断します。
T細胞エピトープの発見と実践における検証
HLA結合スクリーニングから機能検証に至るまで、T細胞プロファイリングのワークフローは、どのペプチドが提示され、どのペプチドが免疫応答を駆動するかを特定するのに役立ちます。これらのアプローチを感染症および免疫原性研究にどのように応用できるかをご覧ください。
どのペプチドがT細胞の提示のためにターゲットとなるHLA対立遺伝子に結合するか?
4,327個のHCMVペプチドを組換えHLA-DRB1*1101でスクリーニングしたところ、HLA結合剤を含む21個のウイルスタンパク質が特定されました。FluoroSpotの検証により、マイクロアレイで同定されたバインダー(KPRKTTRPFKVIIKP、FCTPNVQTRRGRVKI)がHLAマッチPBMCでIFN γ産生を誘導し、ノンバインダーでは誘導しないことが確認され、予測精度が示されました。
免疫原性リスク
どの治療用抗体領域がT細胞免疫原性リスクをもたらすのか?
再組換えHLA-DRB1*01:01によるPD-L1阻害剤のチップベースのHLA結合スクリーニングにより、アテゾリズマブで4つのT細胞エピトープ候補が同定されましたが、ドゥルバルマブでは検出されませんでした。機能的Treg抑制アッセイでは、あるアテゾリズマブのエピトープがT細胞応答を抑制しなかったことが確認され、臨床的に観察されたADA発生率の上昇と相関しています。
T細胞-B細胞一致エピトープ
抗体のエピトープもT細胞応答を引き起こすのでしょうか?
EBNA-1ペプチドのペプチドマイクロアレイスクリーニングにより、EBV感染ドナー血清中の抗体結合エピトープFHPVGEADYが同定されました。機能的ELISpotを用いた検証により、このモチーフを含むペプチドFHPVGEADYFEYHがT細胞を活性化してIFN-γを産生し、EBV免疫に重要なB細胞とT細胞のエピトープが一致していることが明らかになりました。
HLA結合スクリーニングからT細胞検証まで
T細胞エピトープの発見は、HLA分子に結合するペプチドの同定から始まります。HLA結合アッセイは、どの配列がT細胞に提示されるかを明らかにします。当社のチップベースのアプローチにより、高スループットで細胞フリーのスクリーニングと選定候補の機能検証が下流で実現します。
ペプチドマイクロアレイにより、高スループットのHLA結合スクリーニングを行い、候補T細胞エピトープを同定することが可能になります。これらのペプチドは、T細胞活性化やエフェクター機能を評価する機能的アッセイ(例:ELISpotや細胞毒性アッセイ)や、フローサイトメトリーによる表現型解析を用いて合成・評価されます。
T細胞免疫に関する疑問に答えました:機能的アッセイのガイド
HLA結合はT細胞の提示能力を持つペプチドを特定しますが、機能的アッセイはそれらが実際に免疫応答を引き起こすかどうかを確認します。活性化スクリーニングから表現型、機能的特徴解析に至るまで、シリコデータを超えたエピトープ候補の実験的検証のための包括的なT細胞サービスを提供しています。
起動
これらのペプチドはT細胞を活性化するのか?
ELISpot / フルオロスポット
- 活性化T細胞からのサイトカイン分泌(例:IFN-γ、IL-2、TNF-α)を検出します
- 候補ペプチド間で免疫原性エピトープをランク付け
使用時期
- HLA結合候補の検証
- ワクチンおよび免疫療法エピトープスクリーニング
表現型
どのような種類のT細胞反応が引き起こされるか?
フローサイトメトリーに基づく表現型
- CD4+、CD8+、および調節T細胞のサブセットを区別してください
- 細胞活性化状態を測定し、集団変動を監視します
使用時期
- 生物学製剤の免疫原性評価
- 機構的免疫応答研究
機能
活性化されたT細胞はどのような機能的効果をもたらすか?
細胞毒性および抑制アッセイ
- CD8+ T細胞による標的細胞殺菌の測定
- 調節T細胞の抑制活性を評価する
使用時期
- 腫瘍細胞殺菌の検証
- 結果に影響を与える可能性のある抑制シグナルの特定
T細胞免疫プロファイリングプロジェクト
T細胞免疫プロファイリングのワークフローは、チップベースのHLA結合スクリーニングと機能的検証アッセイを組み合わせ、免疫原性エピトープの同定と確認を行います。以下のワークフローはT細胞エピトープの発見に焦点を当てています。より柔軟な抗体プロファイリングワークフローについては、エピトープマッピングまたはがん免疫学のアプリケーションページをご覧ください。
①ターゲット定義とライブラリ設計
期間：1〜2日間
PEPperPRINT社実施項目
マイクロアレイ設計と実験計画
ターゲット抗原と研究目的に基づき、ペプチドマイクロアレイを設計し、組換えHLA分子(現在はHLAクラスIIのみ)を供給します。マイクロアレイの生産は、お客様によって設計が承認されると開始されます。
お客様の役割
質問の定義を教えてください
実験の課題と抗原配列(FASTA、UniProt IDまたはペプチドリスト)をご教示ください。独自配列情報の場合はNDAの締結も可能です。
②チップベースのHLA結合アッセイ
期間：5〜6週間
ペッパープリントの実施項目
HLA結合スクリーニング
マイクロアレイと組換えHLAが準備できたら、蛍光ベースの免疫アッセイを実施し、結合親和性データに基づいてHLA制限T細胞エピトープ候補を特定します。
お客様の役割
作業は不要です
この時点では何の作業も必要ありません。ご要望があれば、この時点でスキャン結果をお送りいたしますが、通常は報告書と一緒にすべてをお送りします。
③機能的T細胞検証
期間：6〜8週間
PEPperPRINT社の実施項目
アッセイの実行
候補ペプチドを合成(パートナーを通じて)し、ELISpot/FluoroSpot、表現型解析、または細胞毒性アッセイを実施します。実施後、エピトープランキングと機能データを含む完全な報告書を作成します。
お客様の役割
PBMCを提供（PEPperPRINT社が調達することも可能です）
PBMC(新鮮または凍結)を提供するか、検証実験のためにHLAマッチのPBMCを調達しています。
④オプション:抗体単離およびTCR/BCRシーケンス
期間：6〜8週間
PEPperPRINT社の実施項目
分離受容体および配列受容体
抗原特異的B細胞またはT細胞を単離し、単一細胞選別法を用います。RNAシーケンシングを行い、優性クローンの受容体配列を送達します。
お客様の役割
生物学的サンプルの提供
T/B細胞の分離およびTCR/BCRシーケンスのためのPBMCを提供します。
FAQ
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ペプチドマイクロアレイを用いたHLA結合アッセイはどのように機能するのか?
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当社のチップベースのHLA結合アッセイは組換えHLA分子を使用します。数千のペプチドを表示するペプチドマイクロアレイは、ビオチニル化HLAタンパク質と共に培養され、蛍光ストレプタビジンによって結合を検出します。この細胞フリーアプローチにより、エピトープ発見時に新鮮なPBMCの必要性がなくなり、タイムラインを短縮しサンプルの必要量を削減します。HLAタイピング情報は、スクリーニングを行う関連する対立遺伝子の選択や、世界集団を代表する共通対立遺伝子の検査に役立ちます。
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MHCクラスIとクラスIIの両方のエピトープをスクリーニングできますか?
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現在、当社のチップ型HLA結合アッセイは、CD4+ T細胞エピトープの予測を目的として、MHCクラスII（HLA-DR）に焦点を当てています。お客様の研究課題に最適なアプローチについてご相談の際は、お気軽にお問い合わせください。
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B細胞の応答にも関心があります。抗体結合アッセイとHLA結合アッセイを同じアレイで実施することは可能でしょうか?
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異なるサンプルを、同じペプチドセットを用いて並行して検査することは確かに可能ですが、この種の研究では、マイクロアレイを2セット作成することになります。両方の解析を当社に完全に委託していただくことも可能ですし、当社がHLA結合アッセイを実施する一方で、貴施設でエピトープマッピングを行うために、2セット目のマイクロアレイをお送りすることも可能です。
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T細胞エピトープマッピングや機能検証にはどんなサンプルや材料が必要ですか?
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チップを用いたHLA結合アッセイを開始する際には、標的配列および（判明している場合は）HLA情報をご提供いただく必要があります。T細胞機能アッセイについては、標的ペプチドに加え、PBMCが必要となります（いずれもお客様からご提供いただくか、当社で調達することが可能です）。BCR/TCRシーケンスについては、PBMCが必要となります。抗体の単離には血清が必要となります。
