ProSpot® B細胞ELISpotアッセイ
Biospecimen1975細胞レベルにおけるB細胞応答の解析
B細胞ELISpotアッセイにより、検体中に抗体産生性記憶B細胞が存在するかどうかを調べることができます。この手法は、ワクチン接種、感染、薬物治療に対する反応をはじめ、免疫不全患者や自己免疫疾患患者におけるB細胞応答の検出など、あらゆる状況で活用できます。
なぜB細胞ELISpotを用いるのか？
B細胞ELISpotは、記憶B細胞の抗体応答をモニタリングするために一般的に用いられる他の手法を補完するものであり、さらに細胞レベルで応答を詳細に解析できるという利点があります。血清ELISA（あるいは、より多くの抗原や血清を扱う場合には、タンパク質アレイ解析）は、血清抗体価を測定するための有用かつ簡便な方法ですが、このアッセイでは、どの程度の数の細胞が応答を誘導しているかについては示されません。ここで、B細胞ELISpotが非常に有用となります。例えば、存在する抗体分泌細胞（ASC）の数は、ワクチンによって得られる疾患に対する防御効果と相関させることができます。疾患、薬物治療、その他の要因が、応答性記憶B細胞集団の頻度に及ぼす影響は、すべてB細胞ELISpotを用いて解析することが可能です。
ProImmuneにおけるB細胞ELISpot
ProImmuneでは、お客様が自社の研究室でこのアッセイを立ち上げる際のコストと手間を省くため、B細胞ELISpotサービスを提供しています。当社のチームが実験を代行いたしますので、お客様は本業やプロジェクトの計画立案に時間を割くことができます。当社の最適化されたサービスをご利用いただくことで、時間とコストを節約できるだけでなく、当社の専門知識を活用でき、最高の技術を利用しているという安心感も得られます。設計や検体の発送から、レポート作成、データセットの解釈支援に至るまで、プロジェクトのあらゆる側面を当社が管理いたします。
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図1： ProImmune社によるB細胞ELISpot実験。 62,500個のドナー末梢血単核細胞を刺激してすべての記憶B細胞を活性化させ、ELISpot法により総IgG分泌量を測定した。a：刺激群、b：非刺激対照群。
B細胞ELISpot法
メモリーB細胞は、抗体を分泌する前に刺激を受ける必要があり、これはin vitroにおいて、補因子混合物を用いた予備培養ステップで行われる。この刺激によって細胞が増殖するため、存在するASCの数を正確に推定するために、IgG分泌細胞の総数と抗原特異的ASCの数を比較することが一般的である。
抗原をプレートにコーティングして、捕捉マトリックスを形成する。B細胞を含む細胞懸濁液をプレートに加え、抗体産生細胞（ASC）が反応して抗体を産生するようにインキュベートする。分泌された抗体は固定化された抗原に捕捉され、ビオチン化二次抗体およびストレプトアビジン結合酵素を用いて検出することができる（a）。プレートにスポット形成基質を添加すると、各ASCの位置にスポットが形成される。これらのスポットを計数することで、細胞試料中の抗原特異的記憶B細胞の頻度を推定することができる。
あるいは、二次抗体をプレート上に固定化し、可溶性のビオチン化抗原（b）に反応して分泌された抗体を捕捉するために用いることもできる。ここでも、同じストレプトアビジン結合酵素と基質を用いて、各ASCの位置にスポットを残す。
まれな反応を検出するためには、前培養期間を数日間延長するか、CD19を発現する細胞を単離して試験用細胞集団を濃縮することが可能です。
B細胞ELISpotのトラブルシューティング
B細胞ELISpotは、高密度で輪郭のはっきりしたスポットが得られるようになるまで、多くの異なる工程を最適化する必要があるため、実施が容易な実験ではありません。
以下の点については注意が必要です：
- 細胞の取り扱い
- 細胞の調製は、経験豊富な担当者が行うべきである
- 試薬は、安定した性能を確保するために、あらかじめ適格性を確認しておく必要があります
- 文化活動の時間は最適化すべきである
- アッセイの設定とスポットの検出
- 抗体捕捉に最適なレイヤリング構成を決定するには、経験が必要です。
- プレート結合型抗原を使用する場合、抗原を高密度でコーティングすれば鮮明なスポットが得られるが、分泌型抗体がエピトープにアクセスできる状態である必要がある。
- 固定化二次抗体を使用する場合、結合した抗体と分泌された抗体の比率を適切に保つことが重要です。
- 機器およびソフトウェア
- 検査結果の一貫性を確保するためには、検出装置およびソフトウェアのセットアップと検証が重要です。
B細胞ELISpotのアプリケーション
B細胞ELISpotは、抗体応答を解析する必要があるあらゆる場面で有用なアッセイ法です。抗体（体液性）応答は、外来物質に対してB細胞（適応免疫系の一部）によって引き起こされるものであり、B細胞ELISpotは、こうした応答を特異的に測定する方法の一つです。
概して、抗体応答は有益であり、インフルエンザウイルスなどの病原体の不活化につながります。ワクチン開発者は、綿密に設計されたワクチンを用いて抗体応答を誘導できることに依存しており、この応答は、将来特定の病原体に遭遇した際の防御となる。したがって、B細胞ELISpotは、ワクチン開発の2つの段階で有用である。第一に、病原体に対する正常な抗体応答を特徴づける段階、そして第二に、ワクチンが被験者に誘導しうる防御的な抗体応答を測定する段階である。
望ましくない抗体応答の例としては、新規タンパク質治療薬に対する応答が挙げられます。これらは治療効果を損なうだけでなく、患者に害を及ぼす可能性もあります。また、自己免疫疾患で産生される自己抗体もその一例です。B細胞ELISpotは、これら両者を調査するための優れた手法です。さらに、薬剤によるものや免疫不全に起因する免疫調節の影響についても、B細胞ELISpotを用いて正確にモニタリングすることができます。
感染症
インフルエンザは、「季節性インフルエンザ」という形で脆弱な人々に対して健康上のリスクをもたらすほか、感染力の強いインフルエンザの株が進化し続けているため、一般の人々に対してもリスクをもたらしています 1。防御反応を誘導するための最適なワクチン接種戦略を理解することが重要です。ワクチンはインフルエンザの各株に応じて微調整される場合がありますが、ワクチンによる反応を確実に誘導する方法が必要です。多くの研究チームは、ワクチンが効果を発揮しているかどうかを判断するために、B 細胞 ELISpot を活用してきました。こうした実験の例としては、Joo ら 2による研究が挙げられます。彼らは B 細胞 ELISpot を用いて、異なる接種部位に対する反応として産生された抗体産生細胞を比較しました。また、Halliley ら3は、ワクチン接種後の抗体産生細胞のピークがいつ発生するかを調査し、Baer ら 4は、異なる「インフルエンザ株」に対する反応を分析して抗体の交差反応性を定量化し、また、広範な特異性を持つ抗インフルエンザワクチンの開発を目指し、ヒトに存在するポリクローナル抗インフルエンザ反応を調査した研究者たち 5によっても利用されています。マラリアもまた、感染力の極めて高い疾患であり、世界的な健康問題の一例である。マラリアの病原体であるマラリア原虫に対する抗体応答は、B細胞ELISpotを用いて効率的に測定することができる 6。
小児疾患に対する予防接種は、その発症率を低下させる確実な方法として定着している。おたふく風邪、百日咳、髄膜炎の研究者たちは皆、B細胞ELISpotの有用性を活用し、疾患や新規ワクチンに対する患者の反応をモニタリングしている 7-10。
HIVの研究においても、B細胞ELISpot法は、ウイルスに対する体液性免疫応答の特性解明に大きな成果を上げてきました。この手法を用いて、HIV-1エンベロープ糖タンパク質（Env）に対するB細胞応答が詳細に解明されています 11。また、プライム／ブースター接種戦略によって誘導される記憶B細胞のプール 12や、抗レトロウイルス治療を受けるHIV患者における一般的な小児用ワクチン抗原に対する体液性応答の喪失 13についても、同様に詳細に報告されている。
がん
がん対策としてのワクチン接種戦略は、過去10年間にわたり精力的に研究されており、抗腫瘍ワクチンや予防ワクチン（腫瘍の原因となるウイルスが特定されている場合）に分類される。例えば、ヒトパピローマウイルス（HPV）に対するワクチン接種は、子宮頸がんの発生率を低下させる試みとして用いられており、ガーダシル®（メルク）およびサーバリックス®（GSK） 14によって誘導されるHPVに対する防御的抗体応答の持続期間を定量化するためには、継続的な研究が必要となる。この研究には、B細胞ELISpotが理想的である。腫瘍の血管新生を標的とし、それによって腫瘍への栄養供給を遮断して増殖を阻止するように設計された治療法に関する最近の研究では、B細胞ELISpotを用いて、治療によって誘導された抗体応答と腫瘍血管系への影響との相関関係を明らかにした 15。
生物防衛
エボラウイルス科（フィロウイルス）によって引き起こされる出血熱は、その致死性の高さから研究が進んでいないが、生物兵器となる可能性がある。そのため、米国陸軍感染症医学研究所の各研究室では、治療法の可能性があるかどうかを調査している。その一環として、同研究所ではB細胞ELISpot法を用いて、フィロウイルス 16に対する免疫応答の解析を行っている。
自己免疫とアレルギー
IgE抗体はアレルギー性疾患の発症において中心的な役割を果たしており、さまざまな条件下で個体がIgE応答を誘導する能力の評価は、B細胞ELISpotを用いて行われてきた17。体液性免疫応答に対するさまざまな要因（例えば、免疫調節剤の存在、感染症や化学療法による免疫抑制など）の影響を理解することは極めて重要であり、B細胞ELISpotはこうした課題に取り組む上で優れた検査法である。
前述のように、望ましくない抗体反応は自己免疫疾患の核心をなしています。B細胞ELISpot法は、自己免疫反応の発現に関する基礎研究 18, 19や、治療中の患者における反応の解明 20, 21など、自己免疫疾患の研究において広く活用されています。
消化器疾患
シゲラ感染症は赤痢を引き起こす可能性があるため、予防策として弱毒生ワクチンの接種が検討されてきた。B細胞ELISpot法は、感染時のシゲラ抗原特異的抗体応答をモニタリングする手段として 22、また弱毒化株によって誘導される免疫原性を検証する手段としても用いられた23。
リファレンス
(2) Joo et al Quantitative analysis of influenza virus-specific B cell memory generated by different routes of inactivated virus vaccination. Vaccine (2010) 28:2186 [PubMedID:20056191]
(3) Halliley et al Peak frequencies of circulating human influenza-specific antibody secreting cells correlate with serum antibody response after immunization. Vaccine (2010) 28:3582[PubMedID:20298818]
(4) Baer et al B cell responses to H5 influenza HA in human subjects vaccinated with a drifted variant. Vaccine. (2010) 28:907 [PubMedID:19932673]
(5) Wrammert et al Rapid cloning of high-affinity human monoclonal antibodies against influenza virus. Nature (2008) 453:667 [PubMedID:18449194]
(6) Weiss et al High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J Immunol Methods. (2012) 375:68. [PubMedID:21963949]
(7) Cruz et al Comparison of long-term humoral memory development after immunisation against Neisseria meningitidis B or diphtheria toxoid. Vaccine. (2010) 28:6841. [PubMedID:20719254]
(8) Cruz et al Generation of long-lived plasma cells to serogroup B Neisseria meningitidis after murine immunisation with an outer membrane protein vaccine. Vaccine. (2007) 25:5046[PubMedID:17524531]
(9) Latner et al Enzyme-linked immunospot assay detection of mumps-specific antibody-secreting B cells as an alternative method of laboratory diagnosis. Clin Vaccine Immunol. (2011) 18:35[PubMedID:21047998]
(10) George-Chandy et al Vaccination with Bordetella pertussis-pulsed autologous or heterologous dendritic cells induces a mucosal antibody response in vivo and protects against infection. Infect Immun. 69:4120 [PubMedID:11349085]
(11) Dosenovic et al Selective expansion of HIV-1 envelope glycoprotein-specific B cell subsets recognizing distinct structural elements following immunization. J Immunol. (2009) 183:3373[PubMedID:19696434]
(12) Brocca-Cofano et al Vaccine-elicited SIV and HIV envelope-specific IgA and IgG memory B cells in rhesus macaque peripheral blood correlate with functional antibody responses and reduced viremia. Vaccine. (2011) 29:3310 21382487 [PubMedID:21382487]
(13) Pensieroso et al Timing of HAART defines the integrity of memory B cells and the longevity of humoral responses in HIV-1 vertically-infected children. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009) 106:7939[PubMedID:19416836]
(14) Romanowski B. Long term protection against cervical infection with the human papillomavirus: review of currently available vaccines. Hum Vaccin. (2011) 7:161 [PubMedID:21307652]
(15) Ren et al Inhibition of tumor angiogenesis in lung cancer by T4 phage surface displaying mVEGFR2 vaccine. Vaccine (2011) 29:5802. [PubMedID:21482223]
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(17) Esen et al Effect of IL-15 on IgG versus IgE antibody-secreting cells in vitro. J Immunol Methods. (2012) 375:7 [PubMedID:21945396]
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(19) Enghard et al Subset size, activation threshold and distribution of autoreactive MZ and FO B cells do not differ in a sex-specific manner in the NZB/W F1 murine lupus model: an experimental mouse study. Lupus. (2011) 20:1240 [PubMedID:21844114]
(20) Jacobi et al Effect of long-term belimumab treatment on B cells in systemic lupus erythematosus: extension of a phase II, double-blind, placebo-controlled, dose-ranging study.Arthritis Rheum. (2010) 62:201 [PubMedID:20039404]
(21) Rehnberg et al Vaccination response to protein and carbohydrate antigens in patients with rheumatoid arthritis after rituximab treatment. Arthritis Res Ther. (2010) 12:R111.[PubMedID:20529331]
(22) Feller et al Comparative evaluation of the antibody in lymphocyte supernatant (ALS) and enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assays for measuring mucosal immune responses to Shigella antigens. Vaccine. (2011) 29:8487 [PubMedID:21939714]
(23) McKenzie et al Safety and immunogenicity of WRSd1, a live attenuated Shigella dysenteriae type 1 vaccine candidate. Vaccine. (2008) 26:3291 [PubMedID:18468742]
