ProSpot® T細胞ELISpotアッセイ

当社の便利で信頼性の高いELISpotサービスを利用して、T細胞ELISpotアッセイを外部委託しましょう

ProImmuneは、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、グランザイムBなど、さまざまなサイトカインを対象とした認定T細胞ELISpotアッセイを用いて、細胞性免疫を測定するための、シームレスで高スループットなコア施設サービスを提供しています。

研究室で時間のかかるELISpotアッセイを自らセットアップするコストと手間を省きましょう。当社の経験豊富なELISpot CROチームが、高い再現性と迅速な納期で、その作業を代行いたします。当社は、1つのプロジェクトにおいて数十～数百の検体をハイスループット形式で処理する能力を有しており、お客様が中核業務やプロジェクト計画に時間を割けるようサポートいたします。

最適化され、検証済みのプロトコルを用いてELISpotアッセイを実施する当社のチームに任せることで、細胞アッセイにありがちなばらつきの問題を回避し、専門施設ならではの効率性と正確性を活かすことができます。

ELISpotアッセイの成功は、適切な採血と検体処理にかかっています。弊社には、これらの重要な工程を確実に実行できるようサポートする豊富な経験があります

当社は、計画の初期段階から結果の評価・解釈に至るまで、お客様を全面的にサポートいたします。その一環として、お客様に代わって血液の処理を行うことも、あるいは外部の細胞採取・処理施設と緊密に連携して、一貫性のあるプロトコルを確立することも可能です。複数の施設で血液を採取し、PBMCを分離する場合、各施設が統一された手法を用い、適時に細胞を処理することが不可欠です。細胞の処理、凍結、輸送手順といった重要な事項については、本試験開始前にパイロット評価を通じて適格性を確認することができます。

ELISpotによる免疫モニタリングの実施実績は、第I相試験から、それぞれ数年以上にわたる複数の並行多施設共同第III相臨床試験まで多岐にわたります。したがって、お客様のプロジェクトの規模の大小にかかわらず、弊社にご依頼いただければ、安心してお任せいただけます。

論文ピックアップ

Geletneky K. et al., Oncolytic H-1 parvovirus shows safety and signs of immunogenic activity in a first phase I/IIa Glioblastoma trial. Molecular Therapy (2017)  https://doi.org/10.1016/j.ymthe.2017.08.016

正しく設定されれば、酵素免疫スポット（ELISpot）アッセイは再現性が高く、感度の高い細胞アッセイであり、特に抗原特異的なCD4+およびCD8+ T細胞の免疫応答の高スループット解析に適しています。このアッセイにより、10万個に1個という極めて低い割合の細胞レベルでも、分泌型サイトカインを検出することが可能です。こうした理由から、ELISpotは現在、T細胞の免疫応答をモニタリングし、新たなT細胞エピトープを検証するための、非常に広く用いられている標準的なアッセイ法となっています。

社内でELISpotアッセイを実施する場合、特に経験の浅いスタッフが担当すると、多大な労力を要し、時間がかかり、結果にもばらつきが生じることがあります。ProImmuneの経験豊富なチームが、ばらつきを最小限に抑えた最適化・標準化されたプロトコルを用いて日常的にこれらのアッセイを実施しています。その専門知識を活用することで、時間とリソースを節約し、リスクを最小限に抑えることが可能です。

多施設共同臨床試験では、一貫性と再現性を確保した形で検体を採取、輸送、処理するという課題があります。細胞性免疫応答をモニタリングするためのアッセイを成功させる上で、検体の物流と前処理は、おそらく最も重要なステップです。当社は、北米およびヨーロッパのどこにいてもお客様の検体を採取し、最大限の均一性を確保できるよう処理を行う経験と能力を有しています。 検体の前処理と輸送。

当社は、他の商用プロバイダーと比較して、ELISpotのアウトソーシングを迅速かつ非常に手頃な価格で実現する、効率的なサービスを開発しました。当社のアッセイは、以下の段階的なプロセスに従った、シンプルで標準化された形式に基づいています：

(1) お客様は、ProImmuneが推奨する最適化されたプロトコル、またはお客様独自の最適化されたプロトコルに従って、細胞の凍結保存を行います。あるいは、ProImmuneが採血チューブに入った新鮮な血液を受け取り、凍結保存を行います。

(2) ProImmuneは、信頼できる配送業者を利用して顧客の施設から細胞を回収します（顧客が独自の配送業者を利用することも可能です）。また、ProImmuneがすでに細胞の処理を行っている場合は、ProImmuneの凍結保存庫から細胞を取り出します。

– ProImmuneでは、必要に応じてオプションとして HLA組織型検査 を実施しています
– ProImmuneでは、必要に応じてオプションとして カスタムペプチド合成 を実施しています

(3) ProImmuneは、最適化されたプロトコルに従って細胞を解凍し、以下のアッセイ形式のうち1つ以上に基づいてELISpotアッセイを実施します：

a. 凍結した未処理のPBMCにおけるCD8⁺およびCD4⁺ T細胞応答を検出するためのELISpotアッセイ。
b. 解凍後にCD8⁺ T細胞が除去された凍結PBMCにおける、CD4⁺ T細胞応答のみを検出するためのELISpotアッセイ。

(4) お客様には、分析報告書およびデータが提供されます。分析報告書には、詳細な分析結果に加え、自動ELISpotリーダーから得られた生データや画像も含まれています。
ご要望に応じて、これらのプロセスを、追加または代替の要件に合わせて調整することが可能です。

他の多くのCROとは異なり、ProImmuneは適応免疫応答の測定において、他に類を見ない豊富な経験を有しています。また、当社は時間と効率が極めて重要であると考えており、その考えに基づき、比類のない迅速な対応と妥協のない品質を提供すると同時に、皆様が想像されるよりも手頃な価格でサービスをご提供できるよう設計されています。

IFN-γ T細胞ELISpotアッセイの検証データ

ELISpotアッセイが一貫して良好な性能を発揮していることを確信するためには、バリデーションが不可欠です。当社は、結果の再現性の高さを自負しています。以下に、当社のバリデーションデータの一例を示します。

ELISpotの統計

ショットノイズは、量子物理学の概念だと考えるかもしれません。しかし実際には、これは細胞アッセイにおける制限要因です。このようなアッセイで反応する細胞を測定する場合、その測定は整数の増分単位でしか行えません。例えば、100万個に1個の割合で反応する細胞を探している場合、1条件あたり25万個の細胞を測定するアッセイでは、単一の反応が検出される確率は4分の1にとどまります。こうした制限により、アッセイの設定に基づいて、実際に達成可能なアッセイのばらつきの限界が決まります。そこで問題となるのは、「この限界にどれだけ近づけるか」ということです。

ケーススタディ

腫瘍溶解性アデノウイルスを用いたがん遺伝子治療の研究において、ヒト患者で初めて腫瘍特異的反応が確認された

Cerullo, V. et. al. (2010). Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients. Cancer Research. 70: 4297-4309. [PubMedID: 20484030]

患者には、ウイルスのE3プロモーターによって発現が制御されるヒト顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を発現する腫瘍溶解性アデノウイルスが投与された。これにより、トランスジーンの発現がアデノウイルスの複製、ひいては腫瘍微小環境に結びつけられた。治療の前後に患者からPBMCを分離し、インターフェロン-γ（IFN-γ）ELISPOTアッセイを実施して、アデノウイルス治療が腫瘍溶解に加えて腫瘍特異的応答を誘導したかどうかを評価した。

がん患者から採取された23のPBMCサンプルが提供され、ProImmune社は、サバイビンおよびHAdV-5 ProMix™ペプチドプールに対するサイトカイン応答を測定するために、IFN-γ ELISPOTアッセイを実施した。サバイビン（BIRC5 PONAB）ペプチドプールは33個のペプチドで構成され、HAdV-5ペントンペプチドプールは140個のペプチドで構成されていました。各プールに含まれるペプチドは15アミノ酸の長さで、11アミノ酸分が重複していました。

細胞サンプルは、抗原刺激に対する反応の可能性を判定するために、IFN-γ ELISPOTアッセイにおいて3回繰り返し分析された。   試験ウェルの結果は、刺激を受けていない細胞（ペプチドなし／陰性対照）の結果、およびフィトヘマグルチニン（PHA、陽性対照）で刺激された細胞の結果と比較された。陰性結果の2倍以上（グラフ上の青い破線で示されている）の場合、その陽性結果は有意であるとみなされる。

その結果、一部の患者において、ウイルス治療が腫瘍特異的な免疫応答をある程度誘導できることが示された。腫瘍溶解性アデノウイルスによる治療を受けたヒト患者において、このような応答が観察されたのは今回が初めてであった。

論文リスト

Cerullo, V et al (2010) Oncolytic adenovirus coding for granulocyte macrophage colony-stimulating factor induces antitumoral immunity in cancer patients.  Cancer Research 70(11):4297-309 [PubMedID: 20484030]Read Case Study

Geletneky, K., et al (2017) Oncolytic H-1 parvovirus shows safety and signs of immunogenic activity in a first phase I/IIa glioblastoma trial. Molecular Therapy. [PubMedID: 28967558]