ProImmune REVEAL® MHCクラスII結合アッセイ

ービスの詳細

ProImmune社のクラスII対立遺伝子向けMHC-ペプチド結合アッセイは、あらゆるタンパク質配列におけるCD4+ T細胞エピトープを迅速に予測できる、強力な無細胞 in vitroアッセイです。このアッセイは、タンパク質配列の中で最も免疫原性が高いと思われるペプチドを特定するため、新規免疫療法の開発において重要な役割を果たすことができます。治療用タンパク質に適用した場合、この情報は、副作用や中和抗体を回避するために、T細胞エピトープを除去するタンパク質工学戦略の開発に役立てることができます。

HLAクラスIIペプチド結合アッセイ

HLA-ペプチド結合アッセイは、オンレートおよびオフレートアッセイや安定性アッセイと組み合わせることで、エピトープ発見プロセスで同定された個々のペプチドの結合特性に関する詳細な情報を得ることができます。

この技術は、がん、感染症、自己免疫疾患、移植など、多くの疾患領域に幅広く応用可能であり、厳しい時間的制約のある治療プログラムに最適です。

機能的細胞アッセイなどの従来のT細胞抗原発見法とは異なり、このアッセイ法は貴重な患者検体を消費せず、各抗原のHLA制限性を一工程で特定できるという利点があります。したがって、この技術は大幅な時間の節約につながり、エピトープ発見プロジェクトにおける総コストとリスクの低減に寄与します。

結合アッセイは、26種類のHLA-DR、11種類の-DQ、19種類の-DPの対立遺伝子（包括的なリストについては下表を参照）および マウスのクラスII対立遺伝子H-2 IAbおよびIAdに対して利用可能です。

クラスII HLA対立遺伝子へのペプチド結合を予測するアルゴリズムは多岐にわたりますが、こうした インシリコ アプローチの精度は、必ずしも実際の結合データと良好な相関を示すとは限りません。ProImmune社のREVEAL®クラスII HLA結合アッセイは、ペプチド配列がHLA対立遺伝子に結合するかどうかを確実に確認することで、こうした制限を克服し、アルゴリズムによるアプローチで生じる偽陽性および偽陰性の結果が占める割合が高いという深刻な問題を解消します。

ProImmune REVEAL® Class II 迅速エピトープ発見システムの各モジュールの詳細

モジュール1：カスタムペプチド合成

HLA-ペプチド結合アッセイには、一連の合成ペプチドが必要ですが、これらはProImmuneのサービスの一環として提供されます。ペプチド配列は、既知のタンパク質からオーバーラッピングペプチドライブラリとして生成されます。ProImmuneの技術アドバイザーが、お客様の対象タンパク質に適したペプチドライブラリの設計を支援いたします。

モジュール 2：  ProImmune REVEAL® クラス II HLA-ペプチド結合アッセイ

ハイスループットHLA-ペプチド結合アッセイは、陽性対照ペプチドと比較して、各候補ペプチドが1つ以上のクラスII HLA対立遺伝子に結合する能力を評価する受託サービスです。このアッセイは、各ペプチドがHLA-ペプチド複合体を安定化させる能力を測定するものです。検出は、このHLA-ペプチド複合体の天然の立体構造の有無に基づいて行われます。

現在、HLA-ペプチド結合アッセイに使用可能なDR、DQ、DPの対立遺伝子は54種類あります。

ProImmune REVEAL®　利用可能なMHCクラスII対立遺伝子

HLA DR	HLA DQ	HLA DP	IA
DRA1*01:01/DRB1*01:01 DRA1*01:01/DRB1*15:01 DRA1*01:01/DRB1*03:01 DRA1*01:01/DRB1*04:01 DRA1*01:01/DRB1*11:01 DRA1*01:01/DRB1*13:01 DRA1*01:01/DRB1*07:01 DRA1*01:01/DRB1*01:02 DRA1*01:01/DRB1*04:02 DRA1*01:01/DRB1*04:04 DRA1*01:01/DRB1*04:05 DRA1*01:01/DRB1*04:07 DRA1*01:01/DRB1*04:08 DRA1*01:01/DRB1*08:04 DRA1*01:01/DRB1*09:01 DRA1*01:01/DRB1*10:01 DRA1*01:01/DRB1*11:02 DRA1*01:01/DRB1*11:03 DRA1*01:01/DRB1*11:04 DRA1*01:01/DRB1*15:02 DRA1*01:01/DRB1*15:03 DRA1*01:01/DRB1*16:01 DRA1*01:01/DRB1*16:02 DRA1*01:01/DRB3*02:02 DRA1*01:01/DRB3*03:01 DRA1*01:01/DRB5*01:01	DQA1*01:01/ DQB1*05:01 DQA1*05:01/DQB1*03:01 DQA1*01:02/DQB1*05:02 DQA1*01:02/ DQB1*06:02 DQA1*03:01/DQB1*03:02 DQA1*01:02/DQB1*06:04 DQA1*02:01/ DQB1*02:02 DQA1*03:01/DQB1*03:01	DPA1*01:03/ DPB1*01:01 DPA1*01:03/DPB1*02:01 DPA1*01:03/DPB1*03:01 DPA1*01:03/ DPB1*04:01 DPA1*01:03/DPB1*04:02 DPA1*01:03/DPB1*05:01 DPA1*02:01/ DPB1*01:01 DPA1*02:01/DPB1*02:01 DPA1*02:01/DPB1*03:01 DPA1*02:01/ DPB1*04:01 DPA1*02:01/DPB1*04:02 DPA1*02:01/DPB1*05:01 DPA1*02:01/ DPB1*06:01 DPA1*02:01/DPB1*09:01 DPA1*02:01/DPB1*11:01 DPA1*02:01/ DPB1*13:01 DPA1*02:01/DPB1*14:01 DPA1*02:01/DPB1*15:01 DPA1*02:01/ DPB1*17:01 DPA1*02:02/DPB1*05:01	H-2 IAd

各ペプチドには、既知のT細胞エピトープである陽性対照ペプチドを基準としたスコアが割り当てられます。さらに、比較のために中間対照ペプチドの結果も示されます。中間対照は、既知のT細胞エピトープ、あるいは特定のクラスII対立遺伝子の場合、α-β対立遺伝子ペアにおけるβ鎖の既知のエピトープです。スコアは、陽性対照ペプチドによって生成されたシグナルに対する、試験ペプチドによって生成されたシグナルの割合（パーセント）として定量的に報告されます。  お客様は、HLA-ペプチド結合アッセイに合格したペプチドの中から、任意の1つまたはすべてを選択し、さらなる反応速度や安定性に関するアッセイを行うことができます。

また、2つの マウス対立遺伝子、H-2 IAb および H-2 IAdについても、結合アッセイが利用可能です。

ProImmune REVEAL® クラスII完全反応率測定法

オンレートおよびオフレートアッセイにより、個々のペプチドの結合特性に関する動態情報が得られます。これらのアッセイは、高親和性ペプチドに比べて特定のHLA対立遺伝子への結合速度が遅い場合がある中親和性ペプチドにとって、特に重要となる可能性があります。もしオフレートも遅いことが確認されれば、ペプチドが一度結合すると相当な期間にわたって提示され続ける可能性があることを示しており、したがって、潜在的なエピトープとしてさらなる研究を行う価値があります。オンレートが速いペプチドが、必ずしも優れたエピトープであるとは限りません。その動態をより詳細に検討すると、オフレートも速いことが判明する場合があり、その場合は優れたエピトープ候補とは言えない可能性があります。最終的なエピトープの検証に使用する細胞サンプルの供給量が限られている場合、レートアッセイのデータを用いて、最も有望な候補ペプチドに対する下流工程の優先順位を決定することもできます。以下のクラスIIアレルについて、完全なレートアッセイが利用可能です：

DRB1
DR1 (DRB101:01)、DR2 (DRB115:01)、DR3 (DRB103:01)、DR4 (DRB104:01)、DRB104:05、 DR5 (DRB111:01)、DR7 (DRB107:01)、DR9 (DRB10901)

ProImmune REVEAL® クラスII クイックチェック安定性アッセイ

クイックチェック安定性アッセイは、DR、DQ、DPクラスのII型対立遺伝子すべてに対応しており、モジュール2：HLA-ペプチド結合アッセイと併せて注文する必要があります。この安定性アッセイでは、37°Cの条件下で、時間0時点および24時間時点における対立遺伝子に結合したペプチドの量を測定し、HLA-ペプチド複合体の安定性を示します。各ペプチドには「安定性指数」が割り当てられ、異なるペプチドエピトープの相対的な安定性を比較することが可能となります。

HLA-ペプチド結合アッセイは、形成された複合体の安定性よりも、ペプチドのオンレート特性をより強く反映します。しかし、安定性アッセイと結合アッセイの結果を組み合わせることで、そのペプチドが良好なT細胞エピトープとなるのに十分な時間、提示され得るかどうかについて、より包括的な情報が得られます。この指標は、測定対象の対立遺伝子全体にわたって、異なるペプチドの結果を比較するための手法を提供します。この結果は、機能的細胞アッセイにおいてさらなる研究に値するペプチドを優先順位付けするための費用対効果の高い方法として活用でき、ユーザーは細胞サンプルの使用や試験に必要な時間を最適化することが可能になる。

エピトープの検証

HLA-ペプチド結合アッセイにより結合ペプチドを同定した後、機能的なT細胞エピトープであるペプチドについては、ELISpot、細胞内サイトカイン染色、T細胞増殖アッセイなどの細胞アッセイを用いて確認することができます。  ProImmuneでは、これらすべてのアッセイを、 細胞解析サービスの一環として提供しています。患者細胞を用いた最終的な検証には、常に適切な細胞サンプルと実験時間が不可欠ですが、HLA-ペプチド結合アッセイおよび速度アッセイから得られるデータは、これらのリソースを最適に活用するのに役立ちます。

ご注文

ProImmune REVEAL® Class IIのカスタマイズサービスは、お客様一人ひとりのニーズに合わせて提供されます。プロジェクトに関する具体的なお見積もりについては、弊社までお問い合わせください。