ProMap® ナイーブCFSE T細胞増殖アッセイ
Biospecimen1975ProImmune社のProMap® T細胞増殖アッセイは、ヘルパーT細胞の増殖を誘導し、ひいてはヘルパーT細胞による免疫応答を引き起こす可能性のあるエピトープ配列を同定するために使用できます。
放射性チミジン取り込みに基づく従来のアッセイとは異なり、本アッセイは高性能なフローサイトメトリー法を採用しており、増殖細胞の割合を正確に測定し、T細胞応答の詳細な表現型解析を可能にするほか、全体的な感度も大幅に向上しています。
ProMap® CFSE増殖アッセイを選ぶ理由
- CFSE色素希釈法は、数千件の論文で引用されている実績のある手法です
- 放射性アッセイよりもはるかに感度が高いです
- フローサイトメトリーによる読み取りにより、生きたCD4+ T細胞など、解析対象となる正しい細胞集団を特定できます
- さらなるサブセットの表現型解析も容易に追加でき、各サブセットの増殖を同時に測定できます
- インテグラルアッセイは、インキュベーション終了時の特定の時間枠ではなく、増殖期間全体にわたる増殖を測定します
ProMap® T細胞増殖アッセイ技術に関するプレゼンテーション
ProMap® T細胞アッセイとペプチド／タンパク質医薬
ProMap® T細胞増殖アッセイは、潜在的なT細胞エピトープの有無を特定するために開発され、新規ペプチドやタンパク質の非臨床段階における創薬に有用です。このアッセイは、構造的に類似した分子間の「相対的免疫原性」の問題に対処することができ、例えば、異なる候補物質を区別したり、潜在的な免疫療法薬の脱免疫化におけるタンパク質工学戦略の成功の度合いを示したりするのに役立ちます。
ProImmune社のREVEAL®免疫原性システムの一環として、ProMap® T細胞増殖アッセイの結果を、50種類以上のクラスII HLA対立遺伝子に対する無細胞HLA-ペプチド結合アッセイの結果と併せて分析することができます。これにより、顧客は1つまたは複数の創薬候補に対するヘルパーT細胞の免疫応答に関する詳細なプロファイルを得ることができます。
ProMap® T細胞増殖アッセイのワークフロー
- HLA型が特定された20～50名のドナー由来のPBMCが、ProImmuneバイオバンクから選定されます
- プロジェクトの要件に応じて、ペプチドライブラリが合成されます
- ドナーのPBMCにCFSE染色剤を標識する
- 各ペプチドを、各ドナー由来のPBMCと共培養する
- ペプチドに対する反応としてCD4+ T細胞が増殖すると、CFSE標識が希釈される
- CFSEのフローサイトメトリー解析をCD4染色と組み合わせて行うことで、細胞分裂を定量化し、抗原性を評価する
主要な論文
英国国防省（MoD）傘下の[dstl]が発表した、ProMap® T細胞アッセイを用いた抗体のヒト化検証
O’Brien LM, Goodchild SA, Phillpotts RJ, Perkins SD. Virology (2012) 426(2):100-5.[PMID:22341308]
英国政府の防衛科学技術研究所（DSTL）の科学者たちは、ProImmune社のT細胞増殖アッセイを用いて、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（VEEV）に対する抗体のヒト化を検証しました。配列ヒト化とは、抗体の動物由来のタンパク質配列をヒト由来のタンパク質配列に置き換える、合理的な設計手法である。しかし、この手法では、その結果として得られる生物製剤の免疫原性が低くなることが保証されるわけではない。配列スキャンを用いたin vitro T細胞アッセイにより、キメラ配列とヒト化配列の違いを示す抗原性データを生成することができます。ケーススタディの全文はこちらをご覧ください。
「Mastering Immunity 2020」カンファレンスからのこの短い動画では、Dr. Tim Hickling（Roche社 免疫安全性部門責任者）が、ProMap® T細胞増殖アッセイがバイオ医薬品の脱免疫化にどのように応用されてきたかを解説しています。
ProMap® T細胞増殖アッセイの詳細
細胞は、蛍光色素である5,6-カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（CFSE）で標識されます。抗原に反応して増殖する細胞では、CFSEの蛍光強度が低下し、これはフローサイトメトリーによって直接測定されます。これはフローサイトメトリーによるアッセイであるため、増殖しているCD4+細胞の割合を正確に測定でき、T細胞応答の詳細な表現型解析が可能であり、放射性チミジン取り込みに基づく従来のアッセイよりも高感度です。
ProImmuneでは、2種類のT細胞増殖アッセイを提供しています：
- ペプチドエピトープマッピング用 ProMap® ナイーブT細胞増殖アッセイ（下記参照）
- 全長タンパク質スクリーニング用 ProScern® DC-T細胞増殖アッセイ
アッセイの詳細
このアッセイは、ヘルパーCD4+ T細胞の増殖を誘発し、ひいては抗薬物抗体（ADA）反応やその他の望ましくない免疫原性を引き起こす可能性のあるペプチドエピトープ配列を特定するために使用されます。また、このアッセイは、例えば免疫療法におけるエピトープ発見など、有益な免疫原性を持つタンパク質配列を評価するためにも使用できます。
本アッセイがCD4+ヘルパーT細胞応答に焦点を当てる場合、CD8+ T細胞を除去し、CFSE標識したドナー由来のPBMCを、対象となる各ペプチド5μMとともに、6つの反復ウェルで7日間培養します。各アッセイプレートには、未処理の対照ウェルが設けられています。また、本アッセイには、既知のMHCクラスII抗原に対する合成ペプチドおよび2種類の強力な全タンパク質抗原からなる参照抗原対照も組み込まれています。
細胞増殖はフローサイトメトリー解析により測定される。ProMap® T細胞アッセイでは、各刺激サンプルについて、非刺激サンプルの結果と比較することにより、「バックグラウンドを超える刺激率（Percentage Stimulation above background）」が算出される。各検体におけるCD4+ CFSE低発現細胞の数は、CD4+細胞総数に対する割合として表される。6回の反復測定値を用いて、「バックグラウンドを超える刺激率」（抗原刺激を受けたCD4+ CFSE低発現細胞の割合から、抗原刺激を受けていないCD4+ CFSE低発現細胞の割合を差し引いた値）を算出する。
6回の反復測定値から平均値と平均の標準誤差が算出される。バックグラウンドを超える刺激の割合が0.5%を超え、かつバックグラウンドを超える2倍の標準誤差よりも大きい場合、その結果は「陽性」とみなされるが、微弱な反応も考慮に入れるため、より緩やかな閾値を適用したデータも提示される。
ペプチド間の比較を可能にするため、 応答指数が算出される。この指数は、各ペプチドに対する応答の大きさ（バックグラウンドを超える刺激率）に、各ペプチドに対する応答を示したドナーの数（抗原性率）を乗じて算出される。
報告書で提示されるデータは以下の通りです：
- 抗原性割合（試験ペプチドに反応したドナーコホートの割合）
- 反応指数
- 反応の有意性（閾値 p ≤ 0.05を用いた一元配置分散分析による）
文献リスト
Mahlangu, J. et al (2016) TRUST trial: BAY 86-6150 use in haemophilia with inhibitors and assessment for immunogenicity. Haemophilia. 22(6): 873-879. [PubMedID: 27501279]
O’Brien et al (2012) A humanised murine monoclonal antibody protects mice from Venezuelan equine encephalitis virus, Everglades virus and Mucambo virus when administered up to 48h after airborne challenge. Virology 426:100 [PubMedID: 22341308] Read Case Study
Wilkinson, I. et al (2021) Fc-engineered antibodies with immune effector functions completely abolished. PLoS ONE 16(12): e0260954. [PubMedID: 34932587]
